Expressão Recombinante de uma Miraculina de Citrus em Pichia pastoris e em Escherichia coli
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Universidade Federal de São Carlos
UFSCar
Campus São Carlos
Ciências Biológicas - CB
UFSCar
Campus São Carlos
Ciências Biológicas - CB
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The high consumption of sugar in Brazil and in the world result in drastic consequences
for human health, causing numerous diseases. In the search for alternatives to reduce
sugar consumption, several studies have emerged related to the development of caloric
and non-caloric sweeteners, of natural or artificial origin. Among the natural compounds
there is a group of proteins that have the property of modifying the flavor of food. Within
this class of molecules, there is the protein called miraculin, from the plant Richardella
dulcifica, native to Africa, which has the property of modifying the acidic taste of food
into sweet. Due to this potential, there are reports of several tests carried out in an attempt
to produce miraculin through recombinant expression in other organisms. However, other
studies have discovered the existence of miraculin-like proteins in other plants, although
there is still no description of miraculin-like proteins with such property. On the other
hand, in silico analyzes allowed finding in Citrus paradisi a protein with a gene sequence
with high similarity to that found in the original miraculin. Therefore, the characterization
of this protein and the exploration of its potential ability to modify flavor may result in
non-caloric alternatives to sweeten acidic foods, thus contributing to an improvement in
human health. Therefore, the objective was the recombinant expression of a miraculin
derived from Citrus paradisi, called Citros_Mir, in Pichia pastoris yeast and in
Escherichia coli bacteria. Cloning was performed in the propagation vector pGEM-T.
Expression in E. coli occur with pET-28a expression vector and the Rosetta strain, in
addition to testing temperatures of 20, 30 and 37ºC, and final concentrations of 0.2; 0.4
and 1.0 mM of the IPTG expression inducer. Expression in P. pastoris was performed
with the pPICZαC expression vector and the X-33 and KM71H strains. In this system,
was test the final concentrations 0.75, 1, 2 and 3% of the methanol expression inducer,
concluding that the yeast presents a better expression of proteins in a culture medium
containing 2% of methanol. The results obtained showed that attempts to express
Citros_Mir in these systems were not efficient, suggesting the need for new tests,
modifying conditions and/or expression systems.
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)
O elevado consumo de açúcar no Brasil e no mundo vem apresentando consequências drásticas à saúde humana, trazendo inúmeras enfermidades. Na busca de alternativas para a diminuição do consumo de açúcar, têm surgido diversos estudos relacionados ao desenvolvimento de adoçantes calóricos e não calóricos, de origem natural ou artificial. Dentre os compostos naturais existe um grupo de proteínas que apresentam a propriedade de modificar o sabor dos alimentos. Dentro dessa classe de moléculas, encontra-se a proteína denominada miraculina, própria da planta Richardella dulcifica, natural da África, a qual detém a propriedade de modificar o sabor ácido dos alimentos em doce. Devido esse potencial, há relatos de diversos ensaios realizados na tentativa de produzir a miraculina através de expressão recombinante em outros organismos. Contudo, outros estudos descobriram a exitência de proteínas semelhantes à miraculina em outras plantas. Em contrapartida, análises in silico permitiram encontrar em Citrus paradisi uma proteína com sequência gênica com alta similaridade àquela encontra encontrada na miraculina original. Sendo assim, a caracterização dessa proteína e a exploração da sua capacidade potencial de modificação de sabor podem resultar em alternativas não calóricas para adoçar comidas ácidas, contribuindo, dessa forma, para uma melhora na saúde humana. Portanto, objetivou-se a expressão recombinante de uma miraculina oriunda de Citrus paradisi, denominada Citros_Mir, em levedura Pichia pastoris e em bactéria Escherichia coli. A clonagem foi realizada no vetor de propagação pGEM-T. Na expressão em E. coli utilizou-se o vetor de expressão pET-28a e a linhagem Rosetta, além de testar as temperaturas de 20, 30 e 37ºC, e as concentrações finais de 0,2; 0,4 e 1,0 mM do indutor de expressão IPTG. A expressão em P. pastoris foi realizada com o vetor de expressão pPICZαC e as linhagens X-33 e KM71H. Nesse sistema, testou-se as concentrações finais 0,75; 1; 2 e 3% do indutor de expressão metanol, concluindo que o sistema de expressão da levedura é mais eficiente em meio de cultivo contendo 2% de metanol. Os resultados obtidos mostraram que as tentativas de expressão da Citros_Mir nesses sistemas não foram eficientes, sugerindo a necessidade de novos testes, modificando as condições e/ou os sistemas de expressão.
2021/00718-5
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)
O elevado consumo de açúcar no Brasil e no mundo vem apresentando consequências drásticas à saúde humana, trazendo inúmeras enfermidades. Na busca de alternativas para a diminuição do consumo de açúcar, têm surgido diversos estudos relacionados ao desenvolvimento de adoçantes calóricos e não calóricos, de origem natural ou artificial. Dentre os compostos naturais existe um grupo de proteínas que apresentam a propriedade de modificar o sabor dos alimentos. Dentro dessa classe de moléculas, encontra-se a proteína denominada miraculina, própria da planta Richardella dulcifica, natural da África, a qual detém a propriedade de modificar o sabor ácido dos alimentos em doce. Devido esse potencial, há relatos de diversos ensaios realizados na tentativa de produzir a miraculina através de expressão recombinante em outros organismos. Contudo, outros estudos descobriram a exitência de proteínas semelhantes à miraculina em outras plantas. Em contrapartida, análises in silico permitiram encontrar em Citrus paradisi uma proteína com sequência gênica com alta similaridade àquela encontra encontrada na miraculina original. Sendo assim, a caracterização dessa proteína e a exploração da sua capacidade potencial de modificação de sabor podem resultar em alternativas não calóricas para adoçar comidas ácidas, contribuindo, dessa forma, para uma melhora na saúde humana. Portanto, objetivou-se a expressão recombinante de uma miraculina oriunda de Citrus paradisi, denominada Citros_Mir, em levedura Pichia pastoris e em bactéria Escherichia coli. A clonagem foi realizada no vetor de propagação pGEM-T. Na expressão em E. coli utilizou-se o vetor de expressão pET-28a e a linhagem Rosetta, além de testar as temperaturas de 20, 30 e 37ºC, e as concentrações finais de 0,2; 0,4 e 1,0 mM do indutor de expressão IPTG. A expressão em P. pastoris foi realizada com o vetor de expressão pPICZαC e as linhagens X-33 e KM71H. Nesse sistema, testou-se as concentrações finais 0,75; 1; 2 e 3% do indutor de expressão metanol, concluindo que o sistema de expressão da levedura é mais eficiente em meio de cultivo contendo 2% de metanol. Os resultados obtidos mostraram que as tentativas de expressão da Citros_Mir nesses sistemas não foram eficientes, sugerindo a necessidade de novos testes, modificando as condições e/ou os sistemas de expressão.
2021/00718-5
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